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β-内酰胺类抗生素诱导革兰氏阴性菌释放内毒素对其疗效的影响
徐能武(解放军第97医院, 江苏徐州221004) 袁建成 肖光夏 郑江 秦孝建(重庆市西南医院烧伤研究所, 重庆400038)
摘 要
探讨β-内酰胺类抗生素在诱导革兰氏阴性菌释放内毒素(LPS)及对感染动物保护效能方面的差异,旨在为临床上防治革兰氏阴性菌感染时正确选择抗生素提供实验依据。
将Wistar大鼠背部做30%TBSA(Ⅲ°)烫伤,创面立即涂铜绿假单胞菌(PA103)悬液1ml(1× 109CFU),72h后制成大鼠烧伤创面脓毒症模型。烧伤脓毒症大鼠随机分为单纯抗生素治疗组、半乳糖胺(GalN)敏化后治疗组及爱兰苔胶(CGN)封闭后治疗组。分别用亚胺培南(IMP,5mg)和头孢他啶(CTZ,10mg)单剂量腹腔注射(i.p.)治疗,对照组施以等量无菌生理盐水,同时,敏化组加用GalN 50mg i.p.,以增强大鼠对LPS的敏感性,封闭组在敏化组的基础上加用CGN 1mg i.p.,以阻断LPS的生物学效应。于抗生素治疗前及治疗后3、6及9h抽静脉血,检测血中细菌浓度,血浆LPS水平,并观察敏化组和封闭组大鼠10d后的死亡率。结果IMP和CTZ均能使大鼠血中菌量显著降低;IMP和CTZ在杀菌过程中均能诱导PA103释放大量LPS,但CTZ组血浆LPS水平显著超过相应的IMP组(P <0.05或P <0.01);与此同时,敏化组大鼠的死亡率CTZ组明显高于IMP组(P <0.05),而在封闭组,两者间的这种差异则消失(P>0.05)。
结果表明,同属β-内酰胺类的IMP和CTZ在杀菌功能方面并无差异,但在诱导细菌释放LPS的能力方面CTZ> IMP;两者间的这种差异直接影响到各自对感染动物的保护效能,提示在临床上防治革兰氏阴性菌感染时,选择诱导细菌释放较少LPS的抗生素(如IMP)可能更为合理。
关键词 β-内酰胺类抗生素; 革兰氏阴性细菌; 内毒素; 烧伤; 感染; 鲎试剂
尽管广谱抗生素的应用,积极的液体复苏,及时的血管活性药物的支持和危重症监护水平在不断提高,但革兰氏阴性细菌的感染仍然是严重烧、创伤病人主要死亡原因之一[1,2]。革兰氏阴性菌感染难治的主要原因是其释放的内毒素(LPS)启动机体不可逆转的炎症反应,促发脓毒症或脓毒性休克,最终导致病人发生多器官功能损害或衰竭而死亡[2～ 4]。β-内酰胺类抗生素历来是防治革兰氏阴性菌感染的重要手段,但国外近年来的研究表明[1,5,7～ 10],抗生素是把“双刃剑” ,因为抗生素在杀灭细菌的同时又诱导革兰氏阴性菌释放大量的LPS,而且这种诱导释放的能力因抗生素的种类而异。由于LPS是烧伤脓毒症及脓毒性休克发病机制中的启动因子,更为重要的是目前尚无一种确切有效而又可供临床应用的LPS拮抗剂,因此,各种抗生素诱导革兰氏阴性菌释放LPS能力的差异,必然最终影响其疗效的优劣。本实验选择目前临床上防治革兰氏阴性菌感染最常用两种抗生素亚胺培南(imipenem,IMP)和头孢他啶(ceftazidime,CTZ),探讨它们在治疗大鼠烧伤创面脓毒症时的杀菌效能,诱导LPS释放,激活炎症介质产生,以及对感染动物保护效能方面的异同,旨在为临床上防治革兰氏阴性菌感染时抗生素的选择提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 材料
1. 1.1 细菌 铜绿假单胞菌PA103(Pseudomonasaeruginosa,PA103)第三军医大学附属西南医院烧伤研究所提供。
1.1.2 抗生素 亚胺培南(IMP),美国Merck Sharp& Dohme公司,批号V5134;头孢他啶(CTZ),英国Glaxo Wellcome公司,批号B4166GA。
1.1.3 动物 Wistar大鼠,体重200± 20g,雌雄不限,第三军医大学外研所实验动物中心提供。
1.1.4 试剂 鲎试仪专用鲎试剂,厦门鲎试剂厂,批号980225;鲎试剂溶解水,厦门鲎试剂厂,批号980125。 D-半乳糖胺(D-galactosamine,GalN)美国Sigma公司,批号117H3911。爱兰苔胶(carrageenan,CGN),美国Sigma公司,批号127H1222。肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)及白介素6(interleu-kine-6,IL-6)放免药盒,北京东亚免疫技术研究所提供。Griess试剂:第三军医大学附属西南医院烧伤研究所提供。
1.1.5 仪器 紫外分光光度计 自动γ-计数仪:放射免疫γ-计数仪 内毒素自动分析仪 荧光显微镜: Olympus
1.2 方法
1.2.1 去热原处理 三角锥瓶、玻璃试管、橡皮塞、吸头,EP管等清洗干净后60℃烘干,各自分装后送钴-60照射彻底去热原。
1.2.2 PA103悬液制备 将PA103划线接种于血琼脂平板,37℃孵育24h,挑取单菌落转移到普通牛肉浸膏培养液中,置水浴恒温振荡器中37℃水浴振荡培养18～ 20h(频率60次/min)。培养液3000r/min离心15min,弃除上清,无菌生理盐水洗涤,再次离心弃除上清,重复洗涤1次后用无菌生理盐水配成细菌浓度为1× 109CFU/ml的细菌悬液(光镜计数法),异硫氰荧光素标记后,置4℃冰箱备用。
1.2.3 大鼠烧伤创面脓毒症模型制作[11] 按文献[11]进行。
1.2.4 动物分组及处理
单纯抗生素治疗组 将大鼠随机(随机表法)分为IMP治疗组、CTZ治疗组和对照组,每组大鼠24只。抗生素给药方案: IMP 5mg /rat,CTZ 10mg /rat,烫伤及涂菌后72h腹腔注射,对照组注射等量无菌生理盐水。
半乳糖胺敏化及抗生素治疗组 将大鼠随机分为IMP+ GalN组、CTZ+ GalN组和GalN+ saline组,每组大鼠10～ 12只。抗生素给药方案同前,GalN50mg /rat,抗生素治疗前1h腹腔注射。爱兰苔胶封闭,半乳糖胺敏化及抗生素治疗组 将大鼠随机分为IMP+ GalN+ CGN组、CTZ+ GalN+ CGN组和GalN+ CGN+ saline组,每组10～ 12只大鼠。抗生素治疗和GalN敏化同前,CGN 1mg /rat,抗生素治疗前2d腹腔注射。
1.2.5 时相点设置和标本采集 共设置4个时相点,0h(抗生素治疗前)和抗生素治疗后3、6及9h,每个时相点6只大鼠。大鼠麻醉后剖腹,直视下腔静脉穿剌采血,取血浆置于去热原EP管中,-36℃贮存待测。
1.2.6 观察指标与检测方法
细菌定量培养及菌种鉴定 取抗凝下腔静脉血100μl,无菌生理盐水10倍稀释后再取100μl于普通血琼脂平板,L棒均匀涂布,37℃孵箱培养24h行菌落计数,并用荧光显微镜检鉴定菌种是否为种植菌PA103。
LPS测定 采用动态浊度法[12],在BET-16细菌内毒素测定仪上进行。血浆TNF和IL-6测定 血浆标本在室温下解冻,测定用放免法,在自动γ计数仪上进行,操作按试剂盒说明书进行。
血浆NO测定 采用Griess法[13]。
死亡率观察 分别观察IMP+ GalN组,CTZ+GalN组,GalN+ saline组,IMP+ GalN+ CGN组,CTZ+ GalN+ CGN组,GalN+ CGN+ saline组大鼠的死亡率,观察期限为烫伤及涂菌后13d。
1.2.7 统计学处理 采用华西医科大学PEMS医学统计程序软件包进行统计学处理,数据以均数±标准差(x±s)表示,检验水准α定为0.05和0.01。
2 结果
2.1 抗生素治疗后血中细菌菌量变化
烫伤及创面涂菌后3d,大鼠血中菌量达103～105CFU/ml。未用抗生素的对照组在各时相点菌量居高不下,而抗生素治疗后各时相点血中菌量迅速减少,至用药后9h血培养已转阴,且IMP和CTZ杀菌效能相似,治疗组各时相点血中细菌数量与对照组相比差异非常显著(P<0.01,Fig.1)。
2.2 血中内毒素水平变化
未治疗组各时相点血浆LPS水平变化不明显;IMP治疗后各时相点血浆LPS逐渐升高,至9h达峰值,其中的3h及9h与治疗前及未治疗组同时相点相等比升高尤为明显;与上述不同,CTZ治疗后血浆LPS水平升高迅速而显著,各时相点与用药前及未治疗组和IMP治疗组同时相点相比差异显著或非常显著(P<0.05或P<0.01,Fig.2)。
2.3 血浆TNF的变化
未用抗生素治疗组(saline组)血浆TNF水平呈缓慢降低趋势,但各时相点差异不显著(P> 0.05);IMP治疗组各时相点血浆TNF变化不显著,与用药前比较无统计学差异(P>0.05);与上述不同,CTZ治疗组用药后各时相点血浆TNF水平升高,尤以3h最为明显,与治疗前及对照组和IMP组同时相点相比差异显著(P<0.05,Fig.3)。
2.4 血浆IL-6水平变化
2.4.1 未用抗生素治疗的对照组 血浆IL-6水平变化小,各时相点间无统计学差异(Fig.4)。
2.4.2 抗生素治疗组 IMP治疗后血浆IL-6水平缓慢上升,至9h升幅最大,与治疗前及对照组同时相点相比有显著差异(P <0.05),CTZ治疗后血浆IL-6水平升高的速度快,幅度大,其6、9h两时相点与治疗前及对照组和IMP组同时相点相比,均有非常显著的统计学差异(P<0.01,Fig.4)。
2.5 血浆NO变化2.5.1 未用抗生素治疗的对照组 血浆NO水平在各时相点无显著变化(Fig.5)。
2.5.2 抗生素治疗组 IMP治疗后血浆NO水平呈逐渐升高趋,9h升幅最大,3、6、9h 3个时相点与生理盐水对照组同时相点相比,均有显著或非常显著的统计学差异(P <0.05或P <0.01);CTZ治疗后6h血浆NO水平开始升高,9h升幅最大,与治疗前及生理盐水对照组和IMP组同时相点相比,升高更为明显,有非常显著的统计学差异(P<0.01,Fig.5)。
2.6 大鼠死亡率
2.6.1 敏化组大鼠死亡率 3组中CTZ+ GalN组死亡率最高,GalN+ saline组次之,IMP+ GalN组最低,两抗生素治疗组之间的差异有显著统计学意义(P <0.05,Tab.1)。
2.6.2 封闭组大鼠死亡率 经CGN封闭单核-巨噬细胞系统后,各抗生素治疗组死亡率降低,与对照组(GalN+ CGN+ saline组)相比,差异显著(P <0.05),而CTZ和IMP组之间原先的差异消失(P> 0.05,Tab.2)。
2.7 相关分析
IMP治疗的各组大鼠血中各种炎症介质水平与LPS水平呈显著正相关,CTZ治疗组更是如此。相关分析结果见Tab.3。
3 讨论
3.1 抗生素种类对诱导革兰氏阴性菌释放LPS的影响
近十年来国内外研究发现,不同种类的抗生素在诱导革兰氏阴性菌释放LPS能力上存在差异[1,3～ 5,7,8]。我们的研究结果表明:同属β-内酰胺类的IMP和CTZ在治疗铜绿假单胞菌PA103烧伤大鼠创面脓毒症时均能诱导细菌释放大量LPS,但无论释放的数量,还是释放的速度,CTZ都远超过IMP,两者差异非常显著(P<0.01,Fig.2)。提示IMP可能在治疗烧伤后革兰氏阴性菌感染时会诱导较少的内毒素释放,从而对防止或减轻致死性的内毒素血症有益。不同抗生素在诱导革兰氏阴性菌释放LPS能力上的差异,与其对细菌胞壁上不同青霉素结合蛋白(Penicillin Binding Proteins,PBPs)的亲和性有关。国外研究已证实[1,10]:凡是与PBP3亲和性高的抗生素,可诱导细菌产生丝状改变,释放较多的LPS,原因是此类抗生素可抑制细菌分裂,而细菌胞壁不断生长延长从而导致LPS不断释放。而与PBP2亲和性高的抗生素,诱导细菌产生球状变,由于球状体比同等质量的柱状体几何面积小,加之球状体胞壁合成受抑,从而导致LPS合成和释放减少。 IMP属于PBP2高亲和性,CTZ属于PBP3高亲和性,这是两者在诱导革兰氏阴性菌释放LPS能力差异的根本原因。
3.2 血中LPS水平与炎症介质水平间的关系
国内外学者已公认: LPS是致死性炎症级联反应中的启动因子之一[2],抗生素对革兰氏阴性菌的快速杀菌作用导致内毒素大量释放和产生TNF[6]。 TNF、IL-6和NO等则是介导脓毒症及脓毒性休克发生和发展的重要介质[3],LPS释放、炎症介质产生、脓毒症及脓毒性休克发生和发展是三位一体的关系[14]。我们的研究结果及相关分析表明:与IMP相比,CTZ治疗大鼠烧伤创面脓毒症时,血中LPS、TNF及IL-6和NO水平较高(Fig.2～ 5),高水平的LPS与高水平的炎症介质之间关系密切(Tab.3),提示在治疗脓毒症及脓毒性休克时应尽量避用诱导革兰氏阴性菌释放较多LPS的抗生素(如CTZ)。
3.3 抗生素诱导革兰氏阴性菌LPS释放与抗生素疗效间的关系
为了进一步探讨IMP和CTZ在诱导LPS释放及炎症介质产生方面差异的病理生理学意义,我们在实验中设计了对烧伤脓毒症大鼠的敏化实验和封闭实验。半乳糖胺(GalN)是一种可逆性肝细胞毒性物质,通过抑制肝细胞蛋白质合成来阻断肝脏的解毒功能,可显著提高大鼠对LPS的敏感性[13]。实验结果表明:经GalN敏化的CTZ治疗组大鼠的死亡率远高于敏化后IMP治疗组的死亡率,两者差异非常显著(P <0.01,见Tab.1)。爱兰苔胶(CGN)是一种从海藻中提取的多糖类化合物,可选择性封闭肝脏及腹腔单核-巨噬细胞系统对LPS的生物学效应,减少TNF及IL-6等炎性介质的产生。我们在实验中发现,预先用CGN封闭后,同样敏化的烧伤创面脓毒症大鼠死亡率明显降低,而且,IMP和CTZ治疗组间的差异消失(Tab.2),这进一步说明:尽管IMP和CTZ杀菌功能相同,但由于各自诱导革兰氏阴性菌释放LPS及激活炎症介质产生的能力不同,结果导致对感染动物的保护效能也不同,提示抗生素诱导革兰氏阴性菌释放LPS的能力对其疗效有直接影响。
简言之,根据我们的研究得出如下初步结论:
(1)同属β-内酰胺类的IMP和CTZ在对铜绿假单胞菌PA103杀菌效能方面并无明显差异;
(2)IMP和CTZ在杀菌的同时可诱导革兰氏阴性菌释放大量的LPS,释放能力CTZ>IMP;
(3)过量的LPS与高水平炎症介质(如TNF、IL-6及NO等)的产生关系密切;
(4)IMP和CTZ在诱导革兰氏阴性菌释放LPS方面的差异,直接影响到各自对感染动物的保护效能;
(5)由于上述原因,故在临床上治疗革兰氏阴性菌感染所致的脓毒症或脓毒性休克时,选择诱导细菌释放较少LPS的抗生素(如IMP)可能更为合理。
参考文献（略）
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